RefSeq RNA(refseq_rna)

发布日期：2024-06-21 12:54 点击次数：130

NCBI 的 Primer-Blast； Primer3 Plus；

PrimerBank；

一、NCBI 的 Primer-Blast

这个在线软件整合了经典的引物贪图软件Primer3，整合了 NCBI 的 Blast 功能进行引物特异性的考证。

网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ 也不错从 Blast 主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）查找对应的功能。

Primer-Blast 的功能区包括 4 个部分： PCR Template； Primer Parameters； Exon/intron Selection；

Specificity check；

1. 引物贪图，输入要贪图的序列信息，不错是FASTA设施序列，也不错是Accession number / Gi number 。

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2. 对现存引物考证

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3. Intron/exon：若是贪图的引物触及到内含子和外显子的聚首处，可再这个位置遴荐 Primer must span an exon-exon junction。匹配外显子碱基数和内含子长度等选默许即可。

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4. 特异性遴荐（Specificitycheck），这里是树立贪图引物或考证引物时的参考方针数据库和物种，这个需要郑重选一下，因为对效力影响相比大；

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◆ 这里选项整个有 7 种数据库：RefSeq mRNA，Genome (reference assemblies from selected organisms)，RefSeqrepresentative genomes，RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomesfrom all organisms) 和 custom。

◆ 其中RefSeq mRNA与Genome数据库是专科介意的数据，从某种酷爱酷爱上来说更精确。

◆ 非常是，当你用 NCBI 的参考序列当作模板和参考序列数据库当作尺度来贪图引物时，Primer-BLAST 不错贪图出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。5. 贪图好引物后，还是提议用惯例的引物贪图软件，比如oligo6 、primer5 等来考证一下引物的特质，举例引物序列包含的引物本身二聚体、发卡结构、△G 的都备值、错配和引物间二聚体。

二、 Primer3 Plus1、在Pubmed-gene赢得基因序列后，在primer3 plus主页上输入基因序列，首页-汉昌东服装有限公司网址：http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

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2. 点击下方“General Settings”参预子页面，首页-湖士艾染料有限公司于“Product Size Ranges”右侧对话框中输入居品bp数值范围（提议：400傍边最好。过大（>1000bp）加多PCR响适时辰，广州韦廷贸易有限公司太小（<150bp）不易与引物二聚体划分），可默许此页面其他参数不变; GC％介于45%－55%相比好；引物长度22-24bp相比符合；TM值60℃傍边最好；3’端至少 4 个碱基保守，最好为 T，C，G

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3、点击右上绿色按钮Pick Primers，跳转页面后，等于赢得的引物列表，按照 5’到 3’的规章，物业保洁还浮现出引物和居品的基本参数。尽量遴荐 G、C 搁置的引物合成，如下图中红框所示，引物的位置也不错通过效力浮现出来。

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4、遴荐符合的引物后，有必要进行NCBI blast引物考证，掀开网址 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，在序列框中，按照 5’－3’ 规章，输入上游引物和卑劣引物，引物之间用 20 个以上 n来停止。

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5、搜索参数内部，遴荐对应的物种数据库。

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6、遴荐 Somewhat similar sequences (blastn)

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7、点击 Algorithm parameters， Expect threshold 遴荐1000数值， Word Size 遴荐 7。

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8、点击 BLAST，运转比对，出现效力中颜料代表得分。

遴荐引物的原则是：列表中大部分是概念基因，施展引物特异性高；若是出现许多物种，施展该基因在不同物种中保守。

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三、PrimerBank

PrimerBank 是一个 PCR 引物的全球数据库。其引物不错用于 PCR 或 qPCR，共包含最初 306800 个引物，涵盖大精深已知的东说念主和小鼠基因。网址http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/。

掀开主页，遴荐搜索类型，整个有6个选项：GenBank accession、NCBI protein accession、NCBI gene ID、primerbank ID、NCBI gene symbol 以及 keyword ，不错把柄已有信息进行遴荐。这里以小鼠的 beta-actin基因为例。

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1、到 NCBI-数据库中找出 β-actin 的 gene ID，点击右边的分类 mus musculus，效力就出来了，小鼠 beta-actin 的 NCBI gene ID 是 11461，Actb 则是小鼠 beta-actin 的 NCBI gene symbol。

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2、把 gene ID编号11461 输入到 primerbank 里，在这个效力上咱们不错看到 beta-actin 的 NCBI gene ID、GenBank accession、NCBI protein accession、coding DNA length 等信息。输入 beta-actin 的 NCBI gene symbol：Actb，也不错得到换取的效力。

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3、搜索页底部能看到流程考证的引物：

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4、遴荐其中一条点进去不错看到相对应的熔化弧线、电泳效力等信息：

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